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Molekularpathologie

Ansprechpartner:

Prof. Dr. Andreas Bräuninger
Tel.: 0641/985-41130
andreas.braeuninger@patho.med.uni-giessen.de


In der Molekularpathologie werden molekularbiologische Methoden zum Nachweis von genomischen Veränderungen und Erregern in Biopsaten und Resektaten angewandt. Neben der Unterstützung der Diagnostik spielt die Molekularpathologie vor allem bei der Planung gezielter, personalisierter Therapien von Malignomen eine wichtige Rolle. Aktuell werden durch den Einsatz neuer Techniken zur Genomanalyse immer weitere genomische Veränderungen bei Malignomen erkannt und dann passende, auf die jeweiligen genomischen Veränderungen zielende, Therapien entwickelt. Dieser Wissenszuwachs wird von uns zeitnah in neue Nachweisverfahren für Diagnostik und Therapieplanung umgesetzt.

Im Folgenden finden Sie kurze Hintergrundinformationen zu den von uns angebotenen molekularpathologischen Untersuchungen, die alle an Formalin-fixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE) Material sowie Frisch oder Gefrier-asserviertem Gewebe durchgeführt werden können.

Einsendeschein Molekularpathologie

Mutationsnachweise bei Malignomen

KRAS (Gly12 und Gly13)

KRAS wird normalerweise von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen aktiviert. In vielen Tumoren ist KRAS aber mutiert, und Mutationen in den KRAS Kodons 12 und 13 (und wesentlich seltener in Kodon 61) führen zu permanenter KRAS Aktivierung ohne vorherige Aktivierung von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen. Gegen Rezeptor-Tyrosin-Kinasen gerichtete Therapien (Erbitux und Vectibix bei Kolorektalenkarzinomen, Iressa und Tarceva bei Lungenkarzinomen) sind deshalb bei mutiertem KRAS gar nicht mehr oder nur noch teilweise wirksam.
Zur Bestimmung des KRAS Mutationsstatus wird das KRAS Exon 2 aus genomischer DNA mittels PCR amplifiziert und sequenziert.
Literatur: Ciardiello F. and Tortora G. - EGFR antagonists in cancer treatment. NEngJMed 2008; 358(11):1160-74.

BRAF (Val600)

BRAF ist ein wichtiges Signalmolekül, das durch verschiedene Rezeptor-Tyrosin-Kinasen mittels KRAS aktiviert wird. BRAF aktiviert dann eine Kaskade von Serin/Threonin Kinasen, die letzlich Transkriptionsfaktoren durch Phosphorylierungen aktivieren. BRAF kann aber auch durch eine Mutation (V600E oder seltener V600K) unabhängig von Rezeptor-Tyrosin-Kinase Signalen und KRAS permanent aktiviert werden. Diese Mutation wird besonders häufig bei Hauttumoren (ca. 50%) und papillären Schilddrüsenkarzinomen (ca. 50%), aber auch in 10% der Kolorektalen Karzinome beobachtet. Beim Nachweis der V600E Mutation bei malignen Melanomen besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß der Patient auf Zelboraf (Vemurafenib) anspricht.
Zur Bestimmung des BRAF Mutationsstatus wird das BRAF Exon 15 aus genomischer DNA mittels PCR amplifiziert und sequenziert.

EGFR (Exone 18, 19, 20 und 21)

EGFR ist eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase, die auf der Oberfläche vieler epithelialer Zellen ausgeprägt wird. Durch Ligandenbindung an den extrazellulären Teil kommt es zur Aktivierung der Kinasedomäne im intrazellulären Teil, und in der Folge zur Aktivierung mehrerer intrazellulärer Signaltransduktionswege. Durch negative Rückkopplungs-mechanismen wird der aktivierte EGFR in normalen Zellen sehr schnell wieder inaktiviert. In vielen Karzinomen ist der EGFR durch Mutationen oder Amplifikation des gesamten Gens permanent aktiviert. Die Mutationen sind auf wenige "Hot spots" beschränkt: G719 in Exon 18 in ca. 5% der Fälle mit Mutationen, E746-A750 in Exon 19 und L858 in Exon 21 in je ca. 45% der Fälle mit Mutationen. Liegen diese Mutationen vor besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß der Patient auf Gefitinib oder Erlotinib anspricht.Liegt dagegen ein Austausch von Threonin 790 zu Methionin (T790M) in Exon 20 vor, ist kein Ansprechen auf Erlotinib oder Gefitinib zu erwarten.
EGFR Mutationen werden durch Amplifikation der Exone 18, 19 und 21 mittels PCR aus genomischer DNA und anschließender Sequenzierung nachgewiesen,
Literatur: Sharma S.V. - Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer 2007; 7:169-181.
Ciardiello F. and Tortora G. - EGFR antagonists in cancer treatment. NEngJMed 2008; 358(11):1160-74.

KIT (Exone 9, 11, 13 und 17)

Die KIT Rezeptor-Tyrosin-Kinase wird auf hämatopoetischen Vorläuferzellen, Mastzellen, Keimzellen und interstitiellen Cajal Zellen des Magens und Darms ausgeprägt und durch den Liganden SCF aktiviert. Mutationen in KIT, die zu einer Liganden-unabhängigen permanenten Aktivierung führen, sind bei Gastrointestinalen Stroma Tumoren (GIST), Akuter Myeloischer Leukämie (AML), Keimzelltumoren, Mastocytosen/Mastzell Leukämien und Melanomen beschrieben. Die aktivierenden Mutationen betreffen verschiedene "Hot spots" und die Häufigkeiten, mit denen bestimmte "Hot spots" betroffen sind, scheinen zwischen den verschiedenen Tumortypen zu variieren.Bei GISTs sind vor allem die Exone 9 (A501, Y502)(8% aller GISTs) und 11 (diverse Mutationen)(72% aller GISTs), bei Mastocytosen/Mastzell Leukämien vor allem D816 in Exon 17 und Exon 11 (diverse Mutationen), bei Melanomen vor allem Exon 11 (diverse Mutationen), Exon 13 (K642) und Exon 17 (diverse Mutationen) und bei AMLs vor allem Exon 17 (8% aller AMLs) und Exon 8 (D419)(2% aller AMLs) von Muationen betroffen. Tumore mit aktiviertem KIT sprechen oft auf Glivec an. Die Effektivität von Glivec ist bei unmutiertem KIT geringer als bei mutiertem und vom betroffenen "Hot spot" in KIT abhängig. Exon 11 Mutationen sprechen am besten auf Glivec an, bei Exon 9 Mutationen wird von der ESMO eine Dosisverdoppelung empfohlen und bei Exon 17 Mutationen wird häufig Glivec Resistenz beobachtet und mit Sutent (Sunitinib) therapiert. GISTs mit Exon 9 Mutationen und unmutiertem KIT sprechen auf Sutent besser an als GISTs mit Exon 11 Mutationen.
Zum Nachweis von KIT Mutationen werden die interessierende Exone (9, 11, 13 ,17) mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und sequenziert.
Literatur: Heinrich M.C. et al. - Correlation of kinase genotype and clinical outcome in the North American Intergroup Phase III Clinical Trial of Imatinib mesylate for treatment of advanced gastrointestinal stromal tumor: CALGB 150105 study by Cancer and Leukemia Group B and Southwest Oncology Group. JCO 2008; E-published.
Heinrich M.C. - Primary and secondary kinase genotypes correlate with the biological and clinical activity of sunitinib in imatinib-resistent gastrointestinal stromal tumors. JCO 2008; E-published.

PDGFRA (Exone 12, 14 und 18)

PDGFRA ist eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase die von vielen verschiedenen Zelltypen ausgeprägt und normalerweise durch Ligandenbindung (verschiedene PDGF) aktiviert wird. Durch negative Rückkopplungsmechanismen wird aktivierter PDGFRA sehr schnell inaktiviert. PDGFRA ist in vielen Tumoren durch genomische Aberrationen permanent aktiviert, z.B. durch Translokationen bei myelodysplastischen und myeloproliferativen Erkrankungen sowie beim hypereosinophilen Syndrom und chronischer eosinophiler Leukämie. Bei 5-7% der Gastrointestinalen Stroma Tumoren (GIST) sind Mutationen in PDGFRA zu beobachten. Die meisten betreffen Exon 18 (D842)(ca. 80%). Exon 12 (diverse) ist selten (ca. 14%) und Exon 14 (N659) ist äußerst selten (ca. 4%) betroffen. Während das Ansprechen auf Glivec bei Exon 12 Mutationen gut ist, ist es bei Exon 18 Mutationen je nach Mutation unterschiedlich.
Zum Mutationsnachweis werden die interessierenden Exone (12, 14, 18) mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und sequenziert.
Literatur: Corless C.L. et al. - PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumors: frequency, spectrum and in vitro sensitivity to imatinib. JCO 2005; 23:5357-64.

JAK2 (V617F in Exon 14, Exon 12) und MPL (Exon 10)

Die Tyrosin-Kinase JAK2 assoziiert mit Cytokinrezeptoren und aktiviert die STAT Transkriptionsfaktoren nach Cytokinbindung. Bei 95% der Patienten mit Polycythaemia vera, bei 70% der Patienten mit idiopathischer Myelofibrose und bei 60% der Patienten mit essentieller Thrombocythämie ist in der regulatorischen Pseudokinasedomäne von JAK2 das Valin 617 zu Phenylanalin mutiert und JAK2 dauerhaft aktiv. Bei Patienten ohne JAK2 V617F Mutationen sind bei Polycythaemia vera oft Mutationen im JAK2 Exon 12 und bei Patienten mit essentieller Thrombocythämie oder idiopathischer Myelofibrose oft Mutationen im MPL Exon 10 nachzuweisen.

PIK3CA (Exone 11, 22), PIK3R1 (Exone 8, 9, 11, 12, 13) und AKT1 (Exon 3)

Die Phosphatidylinositol-3 Kinase besteht aus den beiden Untereinheiten PIK3CA und PIK3R1, wird von vielen Rezeptor-Tyrosin-Kinasen aktiviert und wirkt über die Aktivierung von AKT1 antiapoptotisch. In allen drei Proteinen werden in Malignomen immer wieder aktivierende Mutationen nachgewiesen (Kolon-, Brust-, Endometrium- und Zervixkarzinomen), die wahrscheinlich das Ansprechen auf Tyrosin-Kinase-Inhibitoren negativ beeinflussen.
Mutationen in PIK3CA sind im wesentlichen auf zwei "Hot spot" Regionen in Exon 11 und Exon 22 beschränkt. Zum Mutationsnachweis werden die PIK3CA Exone 11 und 22 mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und anschließend sequenziert.
Mutationen in PIK3R1 wurden in den Exonen 8, 9, 11, 12 und 13 beschrieben. Zum Mutationsnachweis werden die PIK3R1 Exone 8, 9, 11, 12 und 13 mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und anschließend sequenziert.
AKT1 ist in verschiedenen Tumoren durch eine Mutation (E17K) permanent aktiviert. Zum Nachweis dieser Mutation wird das AKT1 Exon2 mittwels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und sequenziert.
Literatur: Cully M. et al. - Beyond PTEN mutations: the PI3K pathway as an integrator of multiple inputs during tumorigenesis. Nat Rev Cancer 2006; 6:184-92.
Berns K. et al. - A functional genetic approach identifies the PI3K pathway as a major determinant of trastuzumab resistence in breast cancer. Cancer Cell 2007; 12:395-402.
Urick M. et al. – PIK3R1 (p85a) is somatically mutated at high frequency in primary endometrial cancer. Cancer Research 2011; 71: 4061-4067.

p53 (Exone 2-11)

Das p53 Protein wird von dem TP53 Gen kodiert und wird ubiquitär ausgeprägt. Das Protein ist instabil und wird sehr schnell wieder abgebaut. Bei DNA Schäden kommt es zur Stabilisierung. In der Folge wird der Zellzyklus gestoppt und verschiedene Reperaturmechanismen aktiviert. Bei starker p53 Akkumulation kann p53 auch Apoptose induzieren. TP53 ist ein Tumorsuppressorgen und in einer Vielzahl von Malignomen durch Mutationen inaktiviert. Im Gegensatz zu Onkogenen sind Mutationen bei Tumorsuppressorgenen nicht auf wenige Hot spots beschränkt sondern fast im gesamten kodierenden Bereich zu finden.
Zum Nachweis von Mutationen werden die Exons 2 - 11 einzeln mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und anschließend sequenziert.
Literatur: Feng Z. et al. - The tumor suppressor p53: cancer and aging. Cell Cycle 2008; 7(7):842-7.

FAP (APC, alle Exone)

Familiäre adenomatöse Polyposis ist eine vererbte autosomal-dominate Erkankung. Inaktivierende Keimbahnmutationen im APC Gen führen zu einer nuklären beta-Catenin Akkumulation wie sie sonst nach Aktivierung des WNT Signalweges in basalen Stammzellen in Kolonkrypten beobachtet wird. In der Folge der duerhalten nuklären beta-Catenin Akkumulation entstehen Polypen im gesamten Dickdarm.
Zum Nachweis von APC Mutationen werden alle 16 APC Exone einzeln, das sehr lange Exon 10 mittels 10 verschiedener PCRs amplifiziert aus genomischer DANN amplifiziert und anschließend sequenziert. Die Untersuchung des APC Gens auf Mutationen kann nur an Blut oder Gefrier-asserviertem Material vorgenommen werden!
Literatur: de la Chapelle A. - Genetic predisposition to colorectal cancer. Nature Rev Cancer 2004; 4:769-780.

INI/SMARCB1 (Exone 2-9)

Bei atypischer teratoider/rhabdoider Tumoren werden häufig inaktivierende Mutationen in dem Chromatinmodifyer SMARCB1, sowohl somatische als auch in der Keimbahn, nachgewiesen.
Zum Nachweis von SMARCB1 Mutationen werden die Exons 2 - 9 einzeln mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und anschließend sequenziert.
Literatur: Mills A. - Throwing the cancer switch: reciprocal roles of polycomb and trithorax proteins. Nature Rev Cancer 2010;10:669-682.

GNAS1 (Exone 8 und 9)

GNAS1 ist die alpha Untereinheit des stimulierenden G-Proteins (Gs-alpha). Die Aktivität dieses Signaltransduktionsmoleküls wird durch Liganden-induzierte Rezeptoraktivierungen kontrolliert. Durch eine Mutation im Arginin 201 oder Glutamine 227 kommt es zu einer Rezeptor-unabhängigen ständigen Aktivierung. Die R201 und Q227 Mutationen werden regelmäßig bei Patienten mit Fibröser Dysplasie beobachtet.
Zum Nachweis der GNAS1 R201 Mutation wird das Exon 8 des GNAS1 Gens mittels PCR amplifiziert und das PCR Produkt anschließend sequenziert.
Literatur: Cohen MM - Fibrous Dysplasia is a neoplasm. Am J Med Genetics 2001; 98:290-3.

Mutationsanalysen Cancer Panel

Die Verwendung von sogenannten Cancer Panels erlaubt die simultane Untersuchung mehrerer Gene auf Mutationen. Die vollständige Sequenzierung einer großen Zahl von Malignom-Genomen und Exomen hat ergeben, daß offenbar jedes Malignom eine individuelle Kombination von Mutationen aufweist. Zusammen mit der zunehmenden Verfügbarkeit von Medikamenten, die spezifisch bestimmte Signalmoleküle (die häufig Onko- oder Tumorsuppressor-Gene sind) oder Signalwege inhibieren, ergeben sich für Patienten durch die Verwendung von Cancer Panels oft neue Therapieoptionen, die bei der Untersuchung auf die Malignom-Entität „typischen“ Mutationen nicht erkannt worden wären. Die Verwendung von Cancer Panels ist also ein Schritt hin zu einer personalisierten Malignom-Therapie.

Mit dem Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel werden mittels Next generation sequencing nach Multiplex PCR Amplifikation parallel 46 Onkogene und Tumorsuppressorgene auf Mutationen hin untersucht. Die untersuchten Onko- und Tumorsuppressorgene sind häufig in Malignomen mutiert und die nachweisbaren Mutationen sind meist Therapierelevant. Bei dem Comprehensive Cancer Panel ist die Zahl der untersuchten Onko- und Tumorsuppressorgene auf 409 erweitert.

Klonalitätsnachweise bei Lymphomen

IgH

Die wichtigste Funktion von B-Lymphozyten ist die Antikörper-Herstellung. Die genomischen Bereiche, die für die Antikörperbestandteile kodieren (IgH Locus für die schweren Ketten, IgK und IgL Loci für die leichten Ketten), werden in jedem B-Lymphozyt individuell in einem Prozess, der als somatische Rekombination bezeichnet wird, hergestellt. Die dabei entstehende CDRIII Region, die entscheidend für die Antikörperspezifität ist, ist in jedem B-Lymphozyt einzigartig und damit ein Marker für Klonalitätsanalysen. CDRIII Regionen unterscheiden sich nicht nur in der Sequenz sondern auch in der Länge. Mit Primern, mit denen der die CDRIII Region enthaltende genomische Bereich amplifiziert wird, erhält man daher bei Amplifikation mit genomischer DNA aus vielen verschiedenen B-Lymphozyten viele verschieden lange PCR Produkte, während bei klonalen Proliferationen eine PCR Produktlänge dominiert. In den Ig Loci kommt es häufig zu weiteren Veränderungen (Somatische Hypermutation) durch die auch Primerbindungsstellen verändert werden können, so daß Primer möglicherweise nicht mehr binden. Deshalb werden immer mehrere Primer, die in verschiedenen Bereichen der Ig Loci binden, verwendet. Die PCR Produkte werden dann mittels hochauflösender Kapillarelektrophorese aufgetrennt und mittels Fluoreszensmarkierung sichtbar gemacht.
Zum Nachweis von Lymphproliferationen wurden in einer Europa-weiten Zusammenarbeit (BIOMED) Primersysteme für die verschiedenen Ig Loci entwickelt und getestet. Wir verwenden die BIOMED Primersätze IgH A, B und C zur Analyse von B-Lymphozyten Proliferationen.
TCRG
Jeder T-Lymphozyt exprimiert einen spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR), der der Erkennung von Proteinfragmenten, die auf MHC Molekülen präsentiert werden, dient. Die genomischen Bereiche, die für die jeweiligen TCRs kodieren, werden während der T-Lymphozyten Entwicklung individuell in jedem T-Lymphozyt mittels somatischer Rekombination hergestellt, und unterscheiden sich geringfügig in der Länge. Die Unterschiede in der Länge der TCRG Umlagerungen können als Marker bei Klonalitätsanalysen verwendet werden. Bei PCR mit geeigneten Primern zur Amplifikation der TCRG Umlagerungen wird bei nichtklonalen T-Lymphozyten Populationen eine Längenverteilung der PCR Produkte beobachtet, während bei monoklonalen Populationen eine dominate PCR Produkt Länge nachgewiesen wird. Die PCR Produkte werden dann mittels hochauflösender Kapillarelektrophorese aufgetrennt und mittels Fluoreszensmarkierung sichtbar gemacht.
Zum Nachweis von Lymphproliferationen wurden in einer Europa-weiten Zusammenarbeit (BIOMED) Primersysteme für die verschiedenen TCR Loci entwickelt und getestet. Wir verwenden die BIOMED Primersätze TCRG A und B zur Analyse von T-Lymphozyten Proliferationen.
Literatur: van Dongen J.J. et al. - Design and standardisation of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003; 17:2257-317.

Translokationsnachweise

EWSR1/FLI1 RT-PCR, EWSR1/ERG (RT-PCR, EWSR FISH)

In nahezu allen Ewing Sarkomen sind Translokationen, die das EWSR1 Gen und einen ETS Transkriptionsfaktor betreffen, und zu aberranten Fusionstranskriptionsfaktoren führen, nachweisbar. In ca. 85% der Fälle sind t(11;22)(q24;q12) Translokationen, die zu EWSR1-FLI1 Fusionen führen, zu beobachten. Je nach Translokationsbruchpunkt werden zwei Hauptvarianten (Typ 1 und 2) sowie mehrere seltenere Varianten unterschieden. In 10-15% der Ewing Sarkome sind t(21;22)(q22;q12) Translokationen, die zu EWSR1-ERG Fusionen führen, nachzuweisen, und in seltenen Fällen sind die Translokationen t(2;22)(q33;q12) und t(7;22)(q22;q12), die für EWSR1-FEV und EWSR1-ETV1 Fusionsproteine kodieren, zu beobachten.
Die verschiedenen Translokationsprodukte können mittels RT-PCR nachgewiesen werden. Durch Verwendung verschiedener Primer können auch seltene Translokationstypen nachgewiesen werden. Brüche im EWSR1 Gen, die bei Translokationen die EWSR1 betreffen vorliegen, können mittels break apart FISH nachgewiesen werden.
Literatur: Helman L.J. and Meltzer P. - Mechanisms of sarcoma development. Nat Rev Cancer 2003; 3:685-94.

SYT/SSX (RT-PCR, SYT FISH)

Bei Synovial Sarkomen sind in mehr als 90% der Fälle t(X;18)(p11;q11) Translokationen nachzuweisen. Es entstehen aberrante Fusionstranskriptionsfaktoren, die einen SYT Anteil von Chromosom 18 und Anteile von SSX1, 2 oder 4, die alle nahe beieinander auf dem X Chromosom liegen, enthalten.
SYT/SSX1, 2 oder 4 Transkripte werden mittels RT-PCR nachgewiesen. Brüche im SYT Gen, die bei Translokationen die SYT1 betreffen vorliegen, können mittels break apart FISH nachgewiesen werden.
Literatur: Helman L.J. and Meltzer P. - Mechanisms of sarcoma development. Nat Rev Cancer 2003; 3:685-94.

PAX/FKHR (RT-PCR, FKHR FISH)

Bei Alveolaren Rhabdomyosarkomen werden in 75% der Fälle t(2;13)(q35;q14) und in 10% der Fälle t(1;13)(p36;q14) Translokationen beobachtet. Sie kodieren für die Fusionstranskriptionsfaktoren PAX3-FKHR und PAX7-FKHR.
PAX3-FKHR und PAX7-FKHR Transkripte werden mittels RT-PCR nachgewiesen. Brüche im FKHR Gen, die bei Translokationen die FKHR betreffen vorliegen, können mittels break apart FISH nachgewiesen werden.
Literatur: Pfeifer J.D. - Molecular genetic testing in surgical pathology. Lipincott Williams & Wilkins 2006: 212-214.

TLS(FUS)/CHOP(DDIT3) (RT-PCR, FUS FISH, CHOP FISH)

In fast allen Myxoiden Liposarkomen wird die t(12;16)(q13;p11) Translokation, die für den TLS/CHOP Fusionstranskriptionsfaktor kodiert, beobachtet.
Sie kann mittels RT-PCR nachgewiesen werden. Brüche im TLS oder CHOP Gen, die bei Translokationen die TLS und/oder CHOP betreffen vorliegen, können mittels break apart FISH nachgewiesen werden.
Literatur: Pfeifer J.D. - Molecular genetic testing in surgical pathology. Lipincott Williams & Wilkins 2006: 212-214.
BCL1 (FISH)
Cyclin D1 ist ein wichtiger positiver Regulator des Zellzyklus, der von dem CCND1 Gen kodiert wird. Cyclin D1 wird in Mantelzell-Lymphomen überexprimiert. Ursache für die aberrante Ausprägung ist die Translokation des gesamten CCND1 kodierenden Bereichs in genomische Bereiche, die zu einer starken Transkription des Gens führen. Dies sind in B-Lymphozyten und B-Zell-Lymphomen z.B. die Promotoren der Immunglobulin Loci, die für die schweren und leichten Ketten der Antikörper kodieren. In nahezu allen Mantelzell-Lymphomen sind Translokationen von CCND1 in den IGH Lokus auf Chromosom 14 (t(11;14)(q13;q32)) zu beobachten.
Mit break-apart FISH Sonden können Brüche im CCND1 Lokus, und damit mit hoher Wahrscheinlichkeit CCND1 Translokationen, nachgewiesen werden.
Literatur: Jaffee E.S., Harris N.L., Stein H., and Vardiman J.W. - WHO Classification of Tumors: Tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC Press 2001.

BCL2 (FISH)

Das BCL2 Protein wirkt antiapoptotisch. Es wird bei verschiedenen Tumoren des hämatopoetischen Systems stark ausgeprägt. Eine häufige Ursache für die aberrante Ausprägung ist die Translokation des gesamten BCL2 kodierenden Bereichs in genomische Bereiche die zu einer starken Transkription des Gens führen. Dies sind in B-Lymphozyten und B-Zell-Lymphomen z.B. die Promotoren der Immunglobulin Loci, die für die schweren und leichten Ketten der Antikörper kodieren. In Follikulären Lymphomen sind Translokationen von BCL2 vor allem in den IGH Lokus auf Chromosom 14 (t(14;18)(q32;q21)) und seltener in den IGK Locus auf Chromosom 2 (t(2;18)(p12;q21)) in 70-95% der Fälle zu beobachten.
Mit break-apart FISH Sonden können Brüche im BCL2 Lokus, und damit mit hoher Wahrscheinlichkeit BCL2 Translokationen, nachgewiesen werden.
Literatur: Jaffee E.S., Harris N.L., Stein H., and Vardiman J.W. - WHO Classification of Tumors: Tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC Press 2001.

c-MYC (FISH)

C-MYC ist ein Transkriptionsfaktor, der die Expression vieler Gene beeinflußt, und in vielen Tumoren verstärkt ausgeprägt wird. Dies gilt auch für sporadische und endemische Burkitt Lymphome. In der Regel ist bei Burkitt Lymphomen die Translokation des gesamten c-MYC kodierenden Bereichs in genomische Bereiche, die zu einer starken Transkription des Gens führen, Ursache für die starke Ausprägung. Solche Bereiche sind in B-Lymphozyten und B-Zell-Lymphomen z.B. die Promotoren der Immunglobulin Loci, die für die schweren und leichten Ketten der Antikörper kodieren. In Burkitt Lymphomen sind Translokationen von c-MYC vor allem in den IGH Lokus auf Chromosom 14 (t(8;14)(q24;q32)) und seltener in den IGK Locus auf Chromosom 2 (t(2;8)(p12;q32)) oder IGL Lokus auf Chromosom 22 (t(8;22)(q32;q11)) in nahezu allen Fälle zu beobachten.
Mit break-apart FISH Sonden können Brüche im c-MYC Lokus, und damit mit hoher Wahrscheinlichkeit c-MYC Translokationen, nachgewiesen werden.
Literatur: Jaffee E.S., Harris N.L., Stein H., and Vardiman J.W. - WHO Classification of Tumors: Tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC Press 2001.

BCL6

BCL6 ist ein Transkriptionsfaktor, der bei B Lymphozyten wichtige Funktionen bei der Keimzentrumsreaktion hat und die Ausprägung vieler Gene reprimiert. Bei etwa 30% der Diffus großzelligen B Zell Lymphome ist BCL6 (auf Chromosom 3q27) von Translokationen betroffen. Neben Translokationen in die Ig Loci werden auch häufig auch andere Translokationen beobachtet.
Brüche im BCL6 Lokus, die bei Translokationen vorliegen, können mit break apart Sonden nachgewiesen werden.
Literatur: Küppers R. – Mechanisms of B-cell pathogenesis. Nature Rev Cancer 2005; 5:251-262.

ALK

Die ALK Rezeptor-Tyrosin-Kinase ist bei verschiedenen Entitäten von Translokationen betroffen. So ist bei den meisten Anaplastisch großzelligen Lymphomen ist die Kinasedomäne von ALK an die Dimerisierungdomäne von NPM t(2;5)(p23;q35) oder anderer Gene fusioniert und bei etwa 5% der Lungenkarzinome führen Inversionen im Chromosom 2p zu EML4/ALK Fusionen. Außerdem werden ALK Translokationen bei Entzündlichen Myofibroblastischen Tumoren beobachtet.
Mit break-apart FISH Sonden können Brüche im ALK Lokus, und damit chromosomale Umlagerungen die ALK betreffen, nachgewiesen werden.
Literatur: Chirale R. et al. – The anaplastic lymphoma kinase in the pathogenesis of cancer. Nature Rev Cancer 2008; 8:11-23.
Salgia R. et al. – Personalized treatment of lung cancer. Semin Oncol 2011; 38: 274-283.

BCR/ABL (RT-PCR, BCR FISH)

Die BCR/ABL Translokation (t(9;22)(q34;q11)) ist bei fast allen Patienten mit Chronischer myeloischer Leukämie und einigen mit Akuter lymphatischer Leukämie nachzuweisen. Durch Fusion der BCR Dimerisierungsdomäne vor die Kinasedomäne von ABL ist das Fusionsprodukt permanent als Tyrosin-Kinase aktiv. Je nach Lage des Bruchpunktes im BCR Gen werden drei Varianten unterschiedlicher Länge (bei CML fast ausschließlich p210, bei ALL auch p185, p230 in seltenen Fällen) generiert.
Alle drei Varianten können mittels RT-PCR nachgewiesen werden. Brüche im BCR, die bei Translokationen die BCR betreffen vorliegen, können mittels break apart FISH nachgewiesen werden.
Literatur: Ruibao R. - Mechanisms of BCR–ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nature Rev Cancer 2005: 5:172-183.

AML1(RUNX1)/ETO(RUNX1T1) (RT-PCR)

Bei 5-10% der Patienten mit Akuter myeloischer Leukämie sind AML1/ETO (FAB Subtyp M2) Translokationen (t(8;21)(q22;q22)), die einen Bestandteil des core binding Faktor verändern, nachweisbar und verursacht einen Differenzierungsblock.
AML1/ETO Translokationen können mittels RT-PCR nachgewiesen werden.
Literatur: Marcucci G. et. Al. – Molecular genetics of adult acute myeloid leukemia: prognostic and therapeutic implications. J Clin Oncol 2011; 29:475-86.

CBFB/MYH11 (RT-PCR)

Bei 5-10% der Patienten mit Akuter myeloischer Leukämie (FAB Subtyp M4Eo) sind CBFB/MYH11 Fusionen (Chromosom 16 (inv(16)(p13q22)), die einen Bestandteil des core binding Faktor verändern, nachweisbar und verursacht einen Differenzierungsblock.
CBFB/MYH11 Translokationen können mittels RT-PCR nachgewiesen werden.
Literatur: Marcucci G. et. Al. – Molecular genetics of adult acute myeloid leukemia: prognostic and therapeutic implications. J Clin Oncol 2011; 29:475-86.

PML/RARA (RT-PCR)

Bei 5-10% der Patienten mit Akuter myeloischer Leukämie (FAB Subtyp M3, Akute Promyelozyten Leukämie) sind PML/RARA Fusionen (t(15;17)()), die einen Differenzierungsblock verursachen, nachzuweisen.
PML/RARA Translokationen können mittels RT-PCR nachgewiesen werden.
Literatur: Marcucci G. et. Al. – Molecular genetics of adult acute myeloid leukemia: prognostic and therapeutic implications. J Clin Oncol 2011; 29:475-86.

FIP1L1/PDGFRA (RT-PCR)

Bei etwa 50% der Patienten mit Hypereosinophilem Syndrom sind interstitielle Deletionen in Chromosom 4q12, die zur Fusion von Teilen des FIP1L1 Gens mit der Kinasedomäne des PDGFRA führen, nachweisbar.
FIP1L1/PDGFRA Fusionstranskripte sind mittels RT-PCR nachweisbar.
Literatur: Cools J. et al. – A tyrosine kinase created by fusion of the PDGFRA and FIP1L1 genes as a therapeutic target of imatinib in idiopathic hyereosinophilic syndrome. New Eng J Medicine 2003; 348:1201-1214.

HaemaVision (RT-PCR)

Neben den häufigen Translokationen und chromosomale Umlagerungen bei akuten und chronischen Leukämien (BCR/ABL, AML1/ETO, CBFB/MYH11, PML/RARA, FIP1L1/PDGFRA) sind noch viele weitere, seltenen vorkommende Translokationen und chromosomale Umlagerungen bekannt.
Mit dem HaemaVision RT-PCR Kit können 28 verschiedene Translokationen und chromosomale Umlagerungen (mit mehr als 80 verschiedenen Bruchpunkten) nachgewiesen werden.
Literatur: Pallisgaard N. et al. – Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood 1998; 92:574-582.

Genomische Zugewinne/Verluste bei Malignomen

HER2

HER2 ist eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase die auf vielen epithelialen Zellen ausgeprägt wird. HER2 wird in ca. 25% aller Brusttumoren und 20% aller Magenkarzinome verstärkt ausgeprägt. Bei Mammakarzinomen haben Patientinnen mit HER2 Überexpression eine schlechte Prognose. Die Überexpression geht auf Amplifikation des HER2 Gens zurück. Mutationen sind bislang nicht beschrieben worden und die starke Überexpression ist anscheinend für eine permanente HER2 Aktivierung ausreichend.
HER2 Amplifikationen werden mittels FISH nachgewiesen.
Literatur: Hudis C.A. - Trastuzumab - mechanisms of action and use in clinical practice. N Eng J Med 2007; 357:39-51.
Fornaro L.- Anti-HER agents in gastric cancer: from bench to bedside. Nature Rev Gastroenterol Hepatol 2011; 8:369-83.

TOP2A

Die Topoisomerase-II-alpha hat wichtige Funktionen bei der DNA-Replikation, Transkription und Chromosomen-kondensation und -segregation. Anthracycline, die als Zytostatika bei verschiedenen Malignomen verwendet werden, inhibieren die Topoisomerase-II-alpha.
Deletionen oder Zugewinne des TOP2A Gens scheinen Marker für eine schlechte Prognose und prädiktiv für das Ansprechen auf Anthracyclin-beinhaltende Chemotherapien bei Brusttumoren zu sein.
TOP2A Amplifikationen oder Verluste werden mittels FISH nachgewiesen.
Literatur: Tanner M. et al. - Topoisomerase IIalpha gene amplification predicts favorable treatment response to tailored and dose-escalated anthracycline-based adjuvant chemotherapy in HER-2/neu-amplified breast cancer: Scandinavian Breast Group Trial 9401. J Clin Oncol 2006; 24:2428-36.

N-MYC

N-MYC, ein Mitglied der MYC Transkriptionsfaktorfamilie, ist essentiell für die Entwicklung des peripheren und zentralen Nervensystems. Das N-MYC Gen ist bei verschiedenen Malignomen, besonders häufig bei Neuroblastomen amplifiziert.
N-MYC Amplifikationen werden mittels FISH nachgewiesen.
Literatur: Pession A. and Tonelli R. – The MYCN oncogene as a specific and selective drug target for peripheral and central nervous system tumors. Curr Cancer Drug Targets 2005; 5:273-283.

Erregernachweise

Mycobakterium tuberculosis

Tuberkulose ist eine bakterielle Infektionskrankheit. Sie wird durch Bakterien des Mycobacterium tuberculosis Komplexes (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti) verursacht.
Die DNA dieser Bakterien kann mittels PCR und Sequenzierung für das M. tuberculosis Komplex spezifische Insertionselement IS6110 nachgewiesen werden. Atypische Mycobakterien werden mit dieser PCR nicht erfaßt.

Helicobacter pylori

Infektionen mit Helicobacter pylori spielen bei einer Reihe von Magenerkrankungen wie Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren eine wichtige Rolle. Bei chronischer Infektion können Magenkarzinome und MALT-Lymphome entstehen und H. pylori wird von der WHO deshalb als kanzerogen eingeordnet. Bei Nachweis von H. pylori ist deshalb eine Eradikationstherapie angezeigt. Wegen des hohen Anteils Antibiotika-resistenter Stämme ist die Bestimmung von Resistenzen vor Therapiebeginn empfehlenswert.
Resistenzen gegen Macrolide (Clarithromycin), Quinolone (Ciprofloxacin) und Tetrazykline werden durch bekannte Mutationen in der 23S rRNA, Gyrase A und der 16S rRNA verursacht.
Zur Bestimmung von Resistenzmutationen werden die entsprechenden Bereiche von H. pylori (23S rRNA für Clarithromycin, Gyrase A für Ciprofloxacin und 16S rRNA für Tetracykine) aus Biopsaten mittels PCR amplifiziert und sequenziert.
Literatur: Owen RJ - Molecular testing for antibiotic resistance in Helicobacter pylori. Gut 2002; 50:285-9.

Human Papillom Viren (HPV)

Humane Papillom Viren (HPV) sind DNA Viren von denen über 100 verschiedene Typen unterschieden werden. Sie infizieren Epithelzellen der Haut und verschiedener Schleimhäute. Einige HPV Typen können Karzinome verursachen. Dabei spielen die HPV Proteine E6 und E7, die die Tumorsuppressorgene P53 und RB binden und inaktivieren, wichtige Rollen. Bei Zervixkarzinomen sind bestimmte Hochrisikotypen in nahezu allen Fällen und bei Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle in etwa 20% der Fälle nachzuweisen.
Zum Nachweis und zur Typisierung von HPV wird zunächst mit Konsensus Primern für alle HPV Typen mittels PCR ein Bereich des HPV Genoms amplifiziert. Die Typisierung erfolgt dann mittels Hybridisierung gegen Typen-spezifische Proben.
Literatur: Roden R., and Wu T.C. - How will HPV vaccines affect cervical cancer? Nat Rev Cancer 2006; 6:753-63.

Humanes Herpes Virus 8 (HHV8)

HHV8 ist ein Gammaherpesvirus mit einem komplexen Genom, das das Verhalten infizierter Zellen durch eine Reihe von Genen mit großen Homologien zu humanen Genen beeinflußt. Es ist an der Pathogenese einiger Malignome beteiligt. So wird HHV8 regelmäßig bei Karposi Sarkomen und häufig bei Primären Effusions Lymphomen sowie beim Morbus Castleman nachgewiesen.
Zum Nachweis von HHV8 wird ein Teil des HHV8 Genoms mittels PCR amplifiziert und dann sequenziert.
Literatur: Qu, L. et al. – Detection of HHV8 genomes in induced peripheral blood mononuclear cells from US blood donors. Vox Sanguinis 2010; 100:267-271.

T. whippelii

T. whippelii ist ein Bakterium das den Morbus Whipple verursacht.
Zum Nachweis wird ein Abschnitt des T. whippelii Genoms aus Biopsaten oder Resektaten mittels PCR amplifiziert und sequenziert.
Literatur: von Herbay A. et al. – Diagnostic application of a polymerase chain reaction assay for the Whippel´s disease bacterium to intestinal biopsies. Gastroenterology 1996; 110:1735-1743.

Parvovirus B19

Das Parvovirus B19 ist ein humanpathogenes Einzelstrang DNA Virus das Ringeröteln und Akute symmetrische Polyarthopathie verursachen kann. Außerdem ist Parvovirus B19 bei etwa 30% der Patienten mit Myokarditis im Herzmuskel nachweisbar.
Zum Parvovirus B19 Nachweis wird ein Fragment des Parvovirus B19 Genoms mittels PCR amplifiziert und sequenziert.
Literatur: Servant A. et al. – Genetic diversity within human Erythroviruses: identification of three genotypes. Journal of Virology 2002; 76; 9124-9134.

Enteroviren

Enteroviren (Coxsackievirus A und B, Poliovirus, Rhinovirus, Echovirus, Enterovirus) sind einzelsträngige RNA Viren, die verschiedene Krankheitsbilder verursachen. Die Coxsackieviren sollen bis zu 50% der Myokarditis Fälle verursachen.
Enteroviren (Coxsackievirus A und B, Poliovirus, Rhinovirus, Echovirus, Enterovirus) werden durch Amplifikation eines Genomfragments mittels RT-PCR mit Konsensus Primern und anschließender Sequenzierung nachgewiesen.
Literatur: Andreoletti L. – Viral causes of human myocarditis. Archieves of Cardiovascular Disease 2009; 102:559-568.

EBV

Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist in über 90% der Erwachsenen in latenter Form in B-Lymphozyten nachweisbar. Während die Erstinfektion von Kindern meist ohne Symptome verläuft, kommt es bei der Erstinfektion von Jugendlichen und Erwachsenen oft zum Ausbruch einer Infektiösen Mononukleose. Die Ausbreitung des Virus wird in gesunden Individuen durch das Immunsystem begrenzt. Bei Immunsuppression nach Transplantationen oder durch das HI-Virus werden häufig EBV-induzierte Lymphoproliferationen oder EBV-positive Lymphome (Burkitt Lymphome, Diffus großzellige B-Zell Lymphome, Posttransplant Lymphome) beobachtet. Außerdem ist EBV in den Tumorzellen des Hodgkin Lymphoms in 40% der Fälle und in Nasopharyngealen Karzinomen nachweisbar.
EBV kann mittels einer in-situ Hybridisierung für die EBER1 und 2 Transkripte, die in allen infizierten Zellen in großen Mengen vorliegen, nachgewiesen werden.
Literatur: Küppers R. - B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus. Nat Rev Immunology 2003; 3:801-12.

Weitere Nachweise

Mikrosatelliteninstabilität bei Kolorektalen Tumoren (MSI)

Bei vielen Kolorektalen Tumoren ist das mismatch repair System inaktiviert. Dadurch kommt es in repetitiven Sequenzen häufig zu kurzen Insertionen oder Deletionen, der sogenannten Mikrosatelliteninstabilität.
Zum Nachweis von Mikrosatelliteninstabilität werden fünf genomische Bereiche, die bei Inaktivierung der Mismatch repair besonders häufig Längenabweichungen aufweisen, mittels PCR aus Tumor und korrespondierendem nicht-Tumor Gewebe amplifiziert. Die PCR Produkte werden dann mittels hochauflösender Kapillarelektrophorese aufgetrennt und mittels Fluoreszensmarkierung sichtbar gemacht. Bei Längenunterschieden zwischen normalem Gewebe und Tumor liegt Mikrosatelliteninstabilität vor.
Literatur: Boland R. et al. – A National Cancer Institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 1998; 58: 5248-5257.

Identitätsnachweise (HID)

Bei Identitätsnachweisen werden Proben miteinander verglichen um festzustellen ob Proben von demselben oder verschiedenen Individuen stammen.
Dazu werden neun genomische Bereiche mit short tandem repeats, Sequenzen mit großer Längenvarianz zwischen Individuen, mittels PCR amplifiziert. Die PCR Produkte werden dann mittels hochauflösender Kapillarelektrophorese aufgetrennt, mittels Fluoreszensmarkierung sichtbar gemacht und die Längenmuster der zu untersuchenden Proben miteinander verglichen. Bei Übereinstimmung aller Längen stammen die Proben von demselben Individuum.
Literatur: Technical working group on DNA analysis – Guidelines for a quality assurance program for DNA analysis. Crime Lab Digest 1995; 22: 21-43.