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Molekulare Diagnostik

Die molekulare Diagnostik gewinnt in den letzten Jahren durch die Identifizierung prognostischer und prädiktiver Markern zunehmend an Bedeutung für die Therapie und den Verlauf neuroonkologischer Erkrankungen. Durch unseren translationalen Forschungsansatz stellen wir sicher, dass in diesem rasant wachsenden Wissenschaftsfeld neueste klinisch-wissenschaftliche Erkenntnisse zügig für die diagnostische Krankenversorgung weiterentwickelt und umgesetzt werden

MOLEKULARE DIAGNOSTIK VON TUMORBIOPSIEN

Die molekulare Diagnostik gewinnt in den letzten Jahren durch die Identifizierung prognostischer und prädiktiver Marker zunehmend an Bedeutung für die Therapie und den Verlauf neuroonkologischer Erkrankungen im Rahmen der Präzisionsmedizin. Durch unseren translationalen Forschungsansatz stellen wir sicher, dass in diesem rasant wachsenden Wissenschaftsfeld neueste klinisch-wissenschaftliche Erkenntnisse zügig für die diagnostische Krankenversorgung weiterentwickelt und umgesetzt werden. Dadurch können wir Ihnen aktuelle und klinisch relevante Untersuchungen internationalen Standards anbieten. 

Folgende molekularpathologische Untersuchungen und diagnostische Biomarkerbestimmungen werden am Institut durchgeführt. Hierfür benötigen wir Formalin fixiertes und Paraffin eingebettetes Material mit repräsentativen Tumoranteilen:
 

IDH1/2 MUTATIONSANALYSE

Punktmutationen im IHD1-Gen (R132) und seltener im IDH2-Gen (R172) werden bei der Mehrzahl der astrozytären und oligodendroglialen Tumore sowie sekundären Glioblastomen gefunden. Punktmutationen innerhalb des IDH1-Gens (Kodon 132) und IDH2-Gens (Kodon 172) sind sowohl bei primären Glioblastomen als auch bei anaplastischen Gliomen mit einer besseren Prognose korreliert (1,2). Die Mutationsanalyse erfolgt in unserem Institut über DNA-Sequenzierung der entsprechenden Genabschnitte. 

1.    Parsons et.al. Science (2008) An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme
2.    Yan et.al. N Engl J Med. (2009) IDH1 and IDH2 mutations in gliomas
 


IDH1 (R132H) Punktmutation

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MGMT-PROMOTOR METHYLIERUNGSANALYSE

In mehreren Studien wurde eine Korrelation des MGMT-Promotor-Methylierungstatus in Glioblastomen und anaplastischen Gliomen mit dem Ansprechen auf eine Chemotherapie mit DNA-alkylierenden Reagenzien (wie z. B. Temozolomid) nachgewiesen (prädiktiver Marker) (1,2). Die Studien NOA-08 und Nordic Trial etablierten den Methylierungsstatus des O6-methylguanin-DNA-Methyltransferase–(MGMT)-Promotors als prädiktiven Biomarker bei älteren Patienten mit Glioblastom, der zur Entscheidung zwischen primärer alleiniger Strahlentherapie und primärer Chemotherapie mit Temozolomid (TMZ), ohne oder mit Strahlentherapie, herangezogen werden kann (3,4). Die Bestimmung des Methylierungsstatus des MGMT-Promotors erfolgt an unserem Institut über die Methylierungs-spezifische PCR (MSP).

1.    Stupp et al. N. Engl J Med (2005) European Organisation for Research and Treatment of Cancer Brain Tumor and Radiotherapy Groups; National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma
2.    Hegi et al. N Engl J Med (2005) MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma
3.    Wick et al. Lancet Oncol (2012) Temozolomide chemotherapy alone versus radiotherapy alone for malignat astrocytoma in the elderly: the NOA-08 randomised, phase 3 trial
4.    Malmström et a. Lancet Oncol (2012) Temozolomide versus standard 6-week radiotherapy versus hypofractionated radiotherapy in patients older than 60 years with glioblastoma: the Nordic randomised, phase 3 trial

 


MGMT-Promotor-Methylierung mit Nachweis einer Methylierung

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TERT-PROMOTOR MUTATIONSANALYSE

TERT-Promotor Mutationen finden sich typischerweise bei Oligodendrogliomen und Glioblastomen sowie bei einer Untergruppe von Meningeomen. IDH Wildtyp Gliome und Glioblastome mit TERT-Promotor Mutationen gehen mit einer ungünstigen Prognose einher (1-3). TERT-Promotor Mutationen in Meningeomen korrelieren mit einem höheren Tumorgrad (Hotspot Mutationen, C228T und C250T in 1,7%, 5,5% und 20% der WHO Grad I, II und III Meningeome) und einem erhöhtem Rezidiv-Risiko (4). Auch in Melanomen konnten wiederkehrende Mutationen innerhalb des TERT-Promotors nachgewiesen werden, welche wichtige protumorigene Mechanismen darstellen (5). Die Mutationsanalyse erfolgt in unserem Institut über DNA-Sequenzierung der entsprechenden Genabschnitte.


1.    Eckel-Passow et al. NEJN. (2015) Glioma Groups based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors.
2.    Arita et al. Acta. Neuropathol. Commun. (2016) A combination of TERT promotor mutation and MGMT methylation status predicts clinically relevant subgroups of newly diagnosed glioblastomas.
3.    Pekmezci et al. Acta. Neuropathol. (2017) Adult infiltrating gliomas with WHO 2016 integrated diagnosis: additional prognostic roles of ATRX and TERT.
4.    Sahm et al. J Natl Cancer Inst. (2015) TERT Promotor Mutations and Risk of Recurrence in Meningioma
5.    Franklin W. Huang et al Science. (2013) Highly recurrent TERT promoter mutations in human melanoma

 

TERT Promotor-Mutation C228T

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DELETION VON 1p19q

Der kombinierte Verlust der Chromosomenarme 1p und 19q (1p/19q Ko-Deletion) bei oligodendroglialen Tumoren korreliert mit der Sensitivität gegenüber Radio- und Chemotherapie und ist mit einer günstigeren Prognose des Krankheitsverlaufes assoziiert (1,2). Die derzeitige Datenlage zeigt, dass die Bestimmung des 1p/19q Status sowohl als prognostischer als auch als prädiktiver Marker bei oligodendroglialen low- und high-grade Tumoren dienen kann (3,4). Am Institut wird der 1p19q Status im Rahmen des EPIC Methylierungsarrays erhoben. 

1.    Cairncross G et al. J Clin Oncol (2006) Phase III trial of chemotherapy plus radiotherapy compared with radiotherapy alone for pure and mixed anaplastic oligodendroglioma: Intergroup Radiation Therapy Oncology Group Trial 9402. 
2.    van den Bent MJ et al. J Clin Oncol. (2006) Adjuvant procarbazine, lomustine, and vincristine improves progression-free survival but not overall survival in newly diagnosed anaplastic oligodendrogliomas and oligoastrocytomas: A randomized European Organization for Research and Treatment of Cancer phase III trial. 
3.    Cairncross G et al. J Clin Oncol. (2013) Phase III Trial of Chemoradiotherapy for Anaplastic Oligodendroglioma: Long-Term Results of RTOG 9402 
4.    Van den Bent Neuro Oncol. (2014) Practise changing mature results of RTOG study 9802: another positive PCV trial makes adjuvant chemotherapy part of standard of care in low-grade glioma

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AKT1- MUTATIONSANALYSE

AKT1-E17K Mutationen finden sich in verschiedenen Tumorentitäten wie z.B. Mammakarzinomen, Kolorektalen-und Ovarialkarzinomen (1). In Tumoren des zentralen Nervensystems lassen sich AKT1-E17K Mutationen typischerweise in Meningeomen nachweisen, insbesondere des meningotheliomatösen- und transitionalen Subtyps (WHO Grad I), in spinaler Lokalisation bzw. an der Schädelbasis, in abnehmender Tendenz mit höherer Graduierung (2-4). AKT1-E17K Mutationen gehen mit einer verkürzten Tumorrezidivzeit einher (5). Die AKT1-E17K Mutation kann als therapeutisches Target genutzt werden (6). Die Mutationsanalyse erfolgt in unserem Institut über DNA-Sequenzierung der entsprechenden Genabschnitte.

1.    Carpten et al. Nature. (2007) A transforming mutation in the pleckstrin homology domain of AKT1 in cancer
2.    Brastianos et al. Nature Genetics. (2013) Genomic sequencing of meningiomas identifies oncogenic SMO and AKT1 mutations
3.    Clark VE et al. Science. (2013) Genomic analysis of non-NF2 meningiomas reveals mutations in TRAF7, KLF4, AKT1, and SMO.
4.    Sahm et al. Acta Neuropathol. (2013) AKT1E17K mutations cluster with meningothelial and transitional meningiomas and can be detected by SFRP1 immunohistochemistry
5.    Yesilöz et al. Neuro-Oncology. (2017) Frequent AKT1E17Kmutations in skull base meningiomas are associated with mTOR and ERK 1/2 activation and reduced time to tumor recurrence
6.    Hyman et al. J Clin Oncol (2017) AKT Inhibition in Solid Tumors With AKT1 Mutations.


AKT1-E17K Punktmutation

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BRAF MUTATIONSANALYSE

Es wird zwischen aktivierenden BRAF V600 Punktmutationen (Klasse I, Monomer), aktivierenden BRAF non-V600 Punktmutationen (Klasse II, Dimer) und inaktivierenden BRAF non-V600 Punktmutationen (Klasse III, Dimer, aktivierter RAS Signalweg) unterschieden (1,2). Unter den häufigsten Tumorentitäten mit BRAF Klasse I V600 Punktmutationen finden sich papilläre Kraniopharyngeome (81-95%), Melanome (60%), papilläre Schilddrüsenkarzinome (40-60%), pleomorphe Xanthoastrozytome (60-80%) und die Histiozytose (30%). Beschrieben wurden BRAF V600 Mutationen auch in Gangliogliomen (20-75%), pilozytischen Astrozytomen (10%) und Glioblastomen (<10%). BRAF mutierte NSCLC (<8%) zeigen mehrheitlich non-V600 Punktmutationen (3-7). Patienten mit BRAF Klasse I Punktmutationen bei nicht kleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC) oder Melanom können von einer kombinierten BRAF-/MEK- Inhibition profitieren (8,9). Die Mutationsanalyse erfolgt in unserem Institut über DNA-Sequenzierung der entsprechenden Genabschnitte.

1.    Yao et al. Nature (2017) Tumours with class 3 BRAF mutants are sensitive to the inhibition of activated RAS.
2.    Dankner et al. Oncogene (2018) Classifying BRAF alterations in cancer new rational therapeutic strategies for actionable mutations.
3.    Davies et al. Nature (2002) Mutations of the BRAF gene in human cancer.
4.    Brastianos et al. Nature (2014) Exome sequencing identifies BRAF mutations in papillary craniopharyngiomas.
5.    Zehir et al. Nature Medicine (2017) Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients.
6.    Bailey et al Cell (2018) Comprehensive Characterization of Cancer Driver Genes and Mutations.
7.    Schindler et al. Acta neuropathologica (2011) Analysis of BRAF V600E mutation in 1,320 nervous system tumors reveals high mutation frequencies in pleomorphic xanthoastrocytoma, ganglioglioma and extra-cerebellar pilocytic astrocytoma.
8.    Flaherty et al. NEJM (2012) Combined BRAF and MEK inhibition in melanoma with BRAF V600 mutations.
9.    Planchard et al. Lancet Oncol (2016) Dabrafenib plus trametinib in patients with previously treated BRAF(V600E)-mutant metastatic non-small cell lung cancer: an open-label, multicentre phase 2 trial.
 


BRAF V600E Punktmutation

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KIAA1549:BRAF FUSIONSTRANSKRIPTE

KIAA1549:BRAF Fusionstranskripte sind hochspezifisch für pilozytische Astrozytome und finden sich bei über 60% aller pilozytischen Astrozytome, häufiger bei infratentorieller Lokalisation und im Kindes- und Jugendalter (1,2). Differentialdiagnostisch kann die Untersuchung auf KIAA1549:BRAF Fusionstranskripte in Verbindung mit einer IDH1-Mutationsanalyse hilfreich sein, um pilozytische Astrozytome (WHO Grad I) von diffusen Astrozytomen (WHO Grad II) abzugrenzen (3). Für die Untersuchung auf KIAA1549:BRAF Fusionstranskripte durch PCR isolieren wir RNA aus Formalin- fixiertem und Paraffin- eingebetteten Material mit repräsentativen Tumoranteilen.

  1. Jakob et al. Br J of Cancer (2009) Duplication of 7q34 is specific to juvenile pilocytic astrocytomas and a hallmark of cerebellar and optic pathway tumours.
  2. Hasselblatt et al. Neuropathol Appl neurobiol (2011) BRAF-KIAA1549 fusion transcripts are less frequent in pilocytic astrocytomas diagnosed in adults.
  3. Korshunov et al. Acta Neuropathol (2009) Combined molecular analysis of BRAF and IDH1 distinguishes pilocytic astrocytoma from diffuse astrocytoma.

 


BRAF-KIAA Fusions-Analyse mit Nachweis eines TYP C Fusionstranskriptes

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HISTON 3.1 UND 3.3-GEN MUTATIONSANALYSE

H3 K27M Mutationen innerhalb des H3F3A (H 3.3)-, HIST1H3B- oder HIST1H3C (H 3.1)-, seltener auch HIST2H3C (H 3.2)- Gens finden sich häufig in Ponsgliomen (DIPG) und diffusen Mittelliniengliomen bzw. supratentoriellen hemisphärischen pädiatrischen High Grade Gliomen (pHGG) des Kindes- oder jungen Erwachsenenalters. H3.3 G34R/V Mutationen finden sich bevorzugt in supratentoriellen hemisphärischen pHGGs und können mit einer besseren Prognose als andere H3 Mutationen einhergehen. H3.1 bzw. H3.2 K27M Mutationen finden sich typischerweise in DIPGs und gehen mit einer bessern Prognose als H3.3 K27M DIPGs einher (1-3). H3.3 K27M DIPGs zeigen ein schlechteres Ansprechen auf Radiotherapie und gehen mit früherer und häufig metastasierten Rezidivbildung einher (4). Durch den Nachweis einer H3F3A oder H3F3B-Mutation kann zwischen einem Riesenzelltumor des Knochens und einem Chondroblastom unterschieden werden. Es konnten in 69% der Riesenzelltumore des Knochens H3F3A Mutationen nachgewiesen werden (G34W/V) verglichen mit 0% aller anderen riesenzellhaltigen Tumore (4). Die Mutationsanalyse erfolgt in unserem Institut über DNA-Sequenzierung der entsprechenden Genabschnitte.


1.    Schwartzentruber et al. Nature (2012) Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma.
2.    Sturm et al. Cancer Cell (2012) Hotspot Mutations in H3F3A and IDH1 Define Distinct Epigenetic and Biological Subgroups of Glioblastoma.
3.    Mackay et al. Cancer Cell (2017) Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.
4.    Castel et al Acta Neurpathol (2015) Histone H3F3A and HIST1H3B K27M mutations define subgroups of diffuse intrinsic pontine gliomas with different prognosis and phenotypes
5.    Cleven et al.; Am J Surg Pathol (2015) Mutation Analysis of H3F3A and H3F3B as a Diagnostic Toll for Giant Cell Tumor of Bone and Chondroblastoma

 
H3F3A K27M Punktmutation

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GNA11- UND GNAQ MUTATIONSANALYSE

Aktivierende Mutationen im GNA11- oder GNAQ-Gen finden sich häufig in primären leptomeningealen melanozytären Neoplasien (GNA11 Mutationen in 18%, 17% und 29% bzw. GNAQ Mutationen in 41%, 30% und 17% leptomeningealer Melanozytome, Melanozytome intermediärer Differenzierung bzw. leptomeningealer Melanome) (1). Daneben zeigen sich diese Mutationen auch im uvealen Melanom oder  malignem blauen Naevus. Sie erlauben eine diagnostische Abgrenzung zu einem melanotischen Schwannom und kutanem Melanom, in denen sich GNA11- oder GNAQ Mutationen nur in niedriger Frequenz (<1%) finden (1-3). Die Mutationsanalyse erfolgt in unserem Institut über DNA-Sequenzierung der entsprechenden Genabschnitte.

1.    Küsters-Vandevelde et al. Brain Pathology. (2015) Primary Melanocytic Tumors of the Central Nervous System: a Review with Focus on Molecular Aspects.
2.    Koelsche et al. Brain Pathology. (2015) Melanotic Tumors of the Nervous System are Characterized by Distinct Mutational, Chromosomal and Epigenomic Profiles.
3.    van de Nes et al. J Neurooncol. (2016) Targeted next generation sequencing reveals unique mutation profile of primary melanocytic tumors of the central nervous system.


GNA11 (Q209L) Punktmutation


GNAQ (Q209L) Punktmutation

 

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CD79B Y196 UND MYD88 L265P MUTATION

Aktivierende Mutationen in MYD88 und CD79B führen zu einer Verstärkung des B-Zell Rezeptor (BCR) Signalwegs. Sie treten gehäuft bei der aktivierten B-Zell like (ABC) Subgruppe der diffus großzelligen Lymphome (ABC-DLBCL) auf, die sich typischerweise in immunprivilegierten Lokalisationen wie dem ZNS finden (1). Die am häufigsten nachgewiesene Mutation ist MYD88 L265P, welche alleine oder in Kombination mit einer CD79B-Y196 Mutation auftreten kann (1,2). MYDD88 und CD79B Mutationen finden sich häufig in primären ZNS-Lymphomen (PCNSL) (3). Eine aberrante Aktivierung des BCR Signalwegs in PCNSL kann als therapeutisches Target dienen (4). Die Mutationsanalyse erfolgt in unserem Institut über DNA-Sequenzierung der entsprechenden Genabschnitte. 

  1. Kraan et al. Blood Cancer J. (2013) High prevalence of oncogenic MYD88 and CD79B mutations in diffuse large B-cell lymphomas presenting at immune-privileged sites.
  2. Davis et al. Nature. (2010) Chronic active B-cell-receptor signalling in diffuse large B-cell lymphoma.
  3. Nakamura et al. Neuropathol Appl Neurobiol. (2016) Recurrent mutations of CD79B and MYD88 are the hallmark of primary central nervous system lymphomas.
  4. Lionakis et al. Cancer Cell. (2017) Inhibition of B Cell Receptor Signaling by Ibrutinib in Primary CNSLymphoma.

CD79B Y196S Punktmutation


MYD88 L265P Punktmutation

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VEGFR-2 (ANTI-VEGF THERAPIE)

Neuartige Therapiestrategien richten sich gegen die Blutgefäßversorgung von Tumoren z.B. über Inhibition des VEGF-Signalwegs über neutralisierende anti-VEGF Antikörper (Avastin). Zahlreiche Studien bestätigen die therapeutische Wirkung dieser Strategien in verschiedenen Tumorentitäten (1,2). Eine Inhibition des VEGF Signalwegs kann mit einer Erhöhung des progressionsfreien Überlebens einhergehen (3,,4). Patienten mit einem proneuralen Glioblastomsubtyp können von einer Inhibition des VEGF Signalwegs besonders profitieren (5). Eine Voraussetzung für die Effizienz dieser Therapie ist eine erhöhte Aktivität des VEGF-Signalwegs. Zur Analyse der Aktivität des VEGF-Signalwegs bestimmen wir immunhistochemisch die Expression von VEGFR-2. Das Vorliegen eines proneuralen Subtyps wird im Rahmen des EPIC Methylierungsarrays bestimmt.

  1. Ferrara N. Nat Rev Cancer. (2002) VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors.
  2. Norden AD et al. Lancet Neurol. (2008) Novel anti-angiogenic therapies for malignant gliomas.
  3. Chinot et al. N Engl J Med. (2014) Bevacizumab plus radiotherapy-temozolomide for newly diagnosed glioblastoma.
  4. Gilbert MR et al. N Engl J Med. (2014) A randomized trial of bevacizumab for newly diagnosed glioblastoma.
  5. Sandmann et al JCO (2015) Patients With Proneural Glioblastoma May Derive Overall Survival Benefit From the Addition of Bevacizumab to First-Line Radiotherapy and Temozolomide: Retrospective Analysis of the AVAglio Trial.


VEGFR-2 Expression in Tumorgefäßen

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EGFR (ANTI-EGF THERAPIE)

EGFR-Inhibitioren wie Erlotinib oder Gefitinib sind etablierte molekulare Therapiestrategien in verschiedenen Tumorentitäten mit aktivierenden Mutationen im EGFR wie z.B. bei non-small cell lung cancer (NSCLC) (1,2). Eine erhöhte Aktivierung des EGFR-Signalwegs über Amplifizierung des Gens oder aktivierende Mutationen (EGFRvIII) wird auch in etwa 1/3 aller Glioblastome beobachtet. Der EGFR Status wird im Rahmen des EPIC Methylierungsarrays erhoben.

  1. Lynch TJ et al. N Engl J Med. (2004) Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.
  2. Mellinghoff IK et al. N Engl J Med. (2005) Molecular determinants of the response of glioblastomas to EGFR kinase inhibitors.

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